一、診斷軟下疳的必備條件
　　
　　一般講，診斷軟下疳要特別謹慎，因為目前本病并不常見，但是如符合如下條件者可以作出診斷。
　　
　　1、發病前有不潔性交史。
　　
　　2、男女生殖器及尿道口出現一個或更多的潰瘍，基底軟，有疼痛與觸痛。
　　
　　3、單側腹股溝橫痃，疼痛，潰瘍排膿。
　　
　　4、暗視野檢查梅毒螺旋體陰性。
　　
　　5、涂片作姬姆薩染色查不到多諾萬小體(由日本人宮川發現的一種導致性病性淋巴肉芽腫的致病菌)。
　　
　　6、梅毒血清試驗陰性。
　　
　　7、革蘭氏染色，可查到陰性鏈球菌，但可產生假陽性，有條件者可作細菌培養。
　　
　　二、診斷軟下疳的實驗室檢查
　　
　　由于本病目前屬于少發性性病，診斷軟下疳應特別慎重。必要的實驗室檢查是診斷軟下疳的關鍵。最簡單的實驗方法是革蘭氏染色涂片。有條件的應作細菌培養和組織病理檢查。
　　
　　1、涂片檢查
　　
　　從潰瘍處取材作涂片時，由于膿性分泌物中的雜菌易使結果混淆，故應先將潰瘍清洗干凈，涂片可用革蘭氏染色或姬姆薩染色。杜克雷菌在涂片中為短小(2μm)的呈平行直線排列的二極染色菌，革蘭氏染色陰性。如果有典型的癥狀，實驗室又能查到杜克雷菌，本病即可診斷。
　　
　　2、細菌培養
　　
　　常用的培養基有淋球菌胎牛血清瓊脂、巧克力馬血瓊脂，取標本時應將潰瘍表面的痂皮和碎屑去掉，用滅菌拭子采取分泌物和潰瘍的基底部物質。將標本接種于平皿上，劃線分離。平皿放入5%～10%二氧化碳和飽和濕度的環境中，于33℃～35℃至少培養48小時看結果。杜克雷菌的菌落較小，如針尖大小，光滑，呈半球形。但菌落常呈不同的形狀，可呈半透明狀、淺灰色和膚黃色等。菌落的特點是緊密，如用接種環觸之，幾乎整個菌落在培養基上滑動。
　　
　　對培養出的菌落可用氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、對輔酶Ⅰ和氯化血紅素等試驗，根據不同需要加以鑒定；也可用過氧化氫酶、吲哚、尿素酶、糖的利用試驗等加以鑒定。對菌珠進行鑒定是診斷軟下疳所必需的。有些不具備條件的實驗室，一發現有細菌生長即診斷本病，是不科學的。
　　
　　3、組織病理檢查
　　
　　對軟下疳患者進行必要的組織病理檢查有助于對本病的診斷。組織病理顯示3個帶，上層為潰瘍底部，較狹窄，可見嗜中性白細胞、纖維蛋白、壞死組織及革蘭氏陰性桿菌；中層頗寬，含多數新生血管，血管內皮細胞增生，血管腔閉鎖，血栓形成；下層在真皮深部，為致密的漿細胞和淋巴細胞浸潤。