一、細菌學檢查
　　
　　嗜血桿菌屬革蘭氏陰性桿菌，培養(yǎng)條件顯示多形性特征，易染性，此菌無芽孢，無運動。
　　
　　1、鏡檢：從軟下疳開放性潰瘍?nèi)〔耐科瑯吮救旧趴死资妊讬z出，未破潰病灶從膿腫或橫痃中穿刺，取其穿刺液涂片標本染色也易檢出，更為典型，用美藍染色或革蘭氏染色等鏡檢，用10×100倍油浸觀察。
　　
　　2、培養(yǎng)檢查：軟下疳菌分離培養(yǎng)較為困難，故在采取病變材料時應注意取軟下疳潰瘍邊緣下貯留膿汁或穿刺橫痃抽吸的膿汁作為檢體，或再用生理鹽水充分洗滌潰瘍底面后，再用生理鹽水濕棉簽涂抹標本送化驗室培養(yǎng)。
　　
　　國際上軟下疳的標準培養(yǎng)基一種是GCHGS（Hammondgonococcalmedia），由淋球菌瓊脂培養(yǎng)基加牛血紅蛋白、胎牛血清、萬古霉素及纖維素、氨基酸等組成；另外一種是MHHb（Muller-Hinton瓊脂，由Muller-Hinton瓊脂、馬血、萬古霉素及其他培養(yǎng)成份組成），上述兩種培養(yǎng)基可以同時應用，以提高陽性率。
　　
　　菌落常于接種后24-48小時形成。色灰黃而透亮，直徑約為1-2mm。從菌落處取材作革蘭染色陰性，為成雙的短桿菌，成鏈狀排列。同時應作生化反應以鑒定之。主要有：氧化酶試驗弱陽性，過氧化酶試驗陰性，非卟啉試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，鹼性磷酸酶試驗陽性。
　　
　　杜克雷嗜血桿菌的培養(yǎng)不僅有助于診斷，而且可確定分離的細菌對抗生素的敏感性，目前已分離出耐抗生素的杜克雷嗜血桿菌。
　　
　　二、血清學診斷軟下疳
　　
　　感染桿克雷嗜血桿菌能產(chǎn)生抗體，通過血清學檢查，不論是補體結合，凝集反應以及熒光抗體間接法等均可證實，但尚未推廣，目前認為IgM抗體敏感性為74%，IgG抗體敏感性為94%，其特異性分別為84%和64%。